УРОЛОГИЯ и ГИНЕКОЛОГИЯ
 АНЕСТЕЗИОЛОГИЯ
 ОТОЛАРИНГОЛОГИЯ
 КАТЕТЕРЫ И ЗОНДЫ
 СТЕКЛА ПРЕДМЕТНЫЕ
 СТЕКЛА ПОКРОВНЫЕ
 Dima diagnostika
 ХЕМА-МЕДИКА ИФА
 ВЕКТОР-БЕСТ ИФА
АЛКОР-БИО ИФА
 ТТГ 0.015-15 мкМЕ/мл
  ТТГ 0.01-2,5 мкМЕ/мл
  Т3
  Т4
 свободный Т4
 атТГ
 атТПО
 ТГ
 Неонатальный ТТГ
 прогестерон
 пролактин
ЛГ
 ФСГ
 ХГч
 АФП
 тестостерон
 ССГ
 СА-125
 ПСА
 свободный ПСА
 ферритин
 общий IgE
 АМПЛИСЕНС ПЦР
 ВЕКТОР-БЕСТ ПЦР
 БЫСТРЫЕ ТЕСТЫ
 ВЕКТОР-БЕСТ БИОХИМИЯ
 СИСТЕМЫ ЗАБОРА КРОВИ
 ПЛАСТИК ЛАБОРАТОРНЫЙ
 ОБОРУДОВАНИЕ ПЦР
 АВТОМАТИЧЕСКИЕ ПИПЕТКИ
27.12.2005   
«УТВЕРЖДАЮ»
Руководитель Департамента
государственного контроля качества,
эффективности, безопасности лекарственных
средств и медицинской техники МЗ РФ
_______________ Р.У. Хабриев
«08» ноября 2000 г.

ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА РЕАГЕНТОВ
ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ЛЮТЕИНИЗИРУЮЩЕГО ГОРМОНА
В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА
(ГонадотропинИФА-ЛГ)

Рекомендована Комиссией по наборам реагентов
для иммуноферментного (неинфекционные),
радиоиммунологического и других видов
иммунохимического анализа Комитета
по новой медицинской технике МЗ РФ
(протокол № 8 от 18 сентября 2000 г.)
ВЗАМЕН ИНСТРУКЦИИ ПО ПРИМЕНЕНИЮ,
УТВЕРЖДЕННОЙ 17 марта 2000 г.

1. НАЗНАЧЕНИЕ

1.1. Набор реагентов «ГонадотропинИФА-ЛГ» предназначен для количественного определения концентрации лютеинизирующего гормона (ЛГ) в сыворотке крови человека методом твердофазного иммуноферментного анализа.

1.2. ЛГ — гликопротеиновый гормон с молекулярной массой около 30000Да, состоящий из двух субъединиц — альфа и бета. ЛГ секретируется базофильными клетками передней доли гипофиза.

У мужчин ЛГ стимулирует синтез тестостерона в лейдиговских клетках семенников. У женщин ЛГ, наряду с другими гормонами, участвует в регуляции менструального цикла.

Повышенные уровни ЛГ наблюдаются у пациентов с различными формами гипогонадизма (первичная недостаточность яичников и семенников, поликистоз яичников, менопауза и пр.), а также при почечной недостаточности и циррозе.

При дисфункциях передней доли гипофиза или гипоталамуса наблюдаются пониженные уровни ЛГ, которые могут являться причиной бесплодия у обоих полов.

Кроме того, количественное определение уровня ЛГ в сыворотке крови имеет диагностическое значение при определении менопаузы, точного времени овуляции и мониторинге эндокринной терапии.

1.3. Набор «ГонадотропинИФА-ЛГ» рассчитан на проведение анализа в дубликатах 40неизвестных, 6калибровочных проб, одной пробы контрольной сыворотки и одной пробы для определения оптической плотности раствора ТМБ при использовании всех стрипов одновременно.
Примечание: В случае дробного применения набор может быть использован в течение месяца после вскрытия компонентов набора.


2. ПРИНЦИП РАБОТЫ НАБОРА

В наборе «ГонадотропинИФА-ЛГ» использован «сэндвич»-вариант твердофазного иммуноферментного анализа. Для реализации этого варианта использованы два моноклональных антитела с различной эпитопной специфичностью к ЛГ. Одно из них иммобилизовано на твердой фазе (внутренняя поверхность лунок), второе конъюгировано с пероксидазой хрена. В лунках, при добавлении исследуемого образца и конъюгата анти-ЛГ-пероксидаза, во время инкубации одновременно происходит иммобилизация ЛГ, содержащегося в исследуемом образце, и связывание его с конъюгатом. При удалении содержимого из лунок и промывке происходит удаление избытка конъюгата анти-ЛГ-пероксидаза, не связавшегося с иммобилизованным в ходе инкубации ЛГ. Количество связавшегося конъюгата прямо пропорционально количеству ЛГ в исследуемом образце.
Во время инкубации с раствором ТМБ происходит окрашивание раствора в лунках. Степень окраски прямо пропорциональна концентрации ЛГ в анализируемых пробах. После измерения оптической плотности раствора в лунках на основании калибровочного графика рассчитывается концентрация ЛГ в определяемых образцах.


3. СОСТАВ НАБОРА

· комплект из двенадцати восьмилуночных стрипов в рамке с иммобилизованными на внутренней поверхности лунок моноклональными антителами к ЛГ, маркирован «Стрипы с моноклональными антителами к ЛГ» — 1пакет;

· калибровочные пробы на основе сыворотки крови, аттестованные по Первому международному референсному препарату 68/40, содержащие известные количества ЛГ; значения концентраций ЛГ в калибровочных пробах указаны на этикетках флаконов — 6флаконов (лиофилизованные препараты или жидкости по 0,5мл);

· конъюгат анти-ЛГ-пероксидаза, маркирован «Конъюгат Е» — 1 флакон (14мл);

· концентрированный буферный раствор для промывки лунок, маркирован «Буфер Р» — 1флакон (20мл);

· раствор тетраметилбензидина, маркирован «Раствор ТМБ»— 1флакон (14мл);

· стоп-реагент, маркирован «Стоп-реагент» — 1флакон (14мл);
· контрольная сыворотка с известным содержанием ЛГ, маркирована «Контрольная сыворотка», 1флакон (лиофилизованный препарат или жидкость 0,5 мл).


4. АНАЛИТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАБОРА

4.1. Специфичность. Не обнаружено перекрестной реакции обоих моноклональных антител к b-субъединице ЛГ с хорионическим гонадотропином, фолликулостимулирующим и тиреотропным гормонами.

4.2. Коэффициент вариации результатов определения ЛГ в одном и том же образце с использованием набора «ГонадотропинИФА-ЛГ» не превышает 8%.

4.3. Линейность. Зависимость концентрации ЛГ в образцах сыворотки крови при разведении их сывороткой крови, не содержащей ЛГ, имеет линейный характер в диапазоне концентраций калибровочных проб № 2–№ 6 и составляет +10%.

4.4. Точность. Данный аналитический параметр проверяется тестом на «открытие» ЛГ — соответствие измеренной концентрации ЛГ предписанной в пробе, полученной путем смешивания равных объемов контрольной сыворотки и калибровочной пробы №3. Процент открытия составляет 90–110.

4.5. Чувствительность. Минимальная достоверно определяемая набором концентрация ЛГ в сыворотке крови человека не превышает 0,3 мМЕ/мл.

4.6. Клиническая проверка. Содержание ЛГ измеряли в сыворотке крови взятой с 9 до 11часов у 40здоровых мужчин в возрасте 21–39лет, 120здоровых женщин в возрасте 19–35лет в различных фазах менструального цикла и 15 женщин в возрасте 49–65лет в постменопаузе. Средняя концентрация ЛГ у мужчин составила 3,9мМЕ/мл (0,8–8,4мМЕ/мл). У женщин в фолликулиновой фазе цикла— 4,2мМЕ/мл (1,1–8,7мМЕ/мл), в овуляторном пике— 32,0мМЕ/мл (13,2–72мМЕ/мл), в лютеиновой фазе цикла— 5,3мМЕ/мл (0,9–14,4мМЕ/мл), в постменопаузе— 39,3мМЕ/мл (18,6–72 мМЕ/мл).
4.7. Рекомендуется в каждой лаборатории при использовании набора уточнить значения концентраций ЛГ, соответствующие нормальным.


5. МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ

5.1. Потенциальный риск применения набора — класс 2а.

5.2. Все компоненты набора в используемых концентрациях являются нетоксичными.

5.3. При работе с набором следует соблюдать «Правила устройства, техники безопасности, производственной санитарии, противоэпидемического режима и личной гигиены при работе в лабораториях (отделениях, отделах) санитарно-эпидемиологических учреждений системы Министерства здравоохранения СССР» (Москва, 1981 г.).

5.4. Стоп-реагент представляет собой 1Н раствор соляной кислоты. Избегать разбрызгивания и попадания на кожу и слизистые. В случае попадания раствора стоп-реагента на кожу и слизистые необходимо промыть пораженный участок большим количеством проточной воды.

5.5. При работе с набором следует надевать одноразовые резиновые или пластиковые перчатки, т.к. образцы и производные крови человека являются потенциально инфицированным материалом, способным длительное время сохранять и передавать ВИЧ, вирус гепатита или любой другой возбудитель вирусных инфекций.

5.6. Химическая посуда и оборудование, которые используются в работе с набором, должны быть соответствующим образом маркированы и храниться отдельно.
5.7. Запрещается прием пищи, использование косметических средств и курение в помещениях, предназначенных для работы с наборами.


6. ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ, НЕОБХОДИМЫЕ ПРИ РАБОТЕ С НАБОРОМ:

· спектрофотометр вертикального сканирования, позволяющий измерять оптическую плотность раствора в стрипах при длине волны 450 нм;

· прибор для встряхивания рамки со стрипами (термостатируемый шейкер), позволяющий производить встряхивание со скоростью 500–800об/мин при температуре +37°С;

· пипетки полуавтоматические одноканальные с изменяемым объемом отбора жидкостей: на 5–50мкл; 40–200мкл; 200–1000 мкл; 1000–5000 мкл с наконечниками;

· пипетка полуавтоматическая восьмиканальная, позволяющая отбирать объемы жидкости до 300мкл, с наконечниками;

· цилиндр мерный, позволяющий отмерять 200 мл;

· стакан стеклянный вместимостью 300 мл;

· вода дистиллированная;

· бумага фильтровальная;
· перчатки резиновые или пластиковые.


7. ПОДГОТОВКА РЕАГЕНТОВ ДЛЯ АНАЛИЗА

7.1. Калибровочные пробы и контрольная сыворотка.

Для восстановления лиофилизованных калибровочных проб и контрольной сыворотки перед вскрытием флаконов легким постукиванием стряхнуть частицы, прилипшие к стенкам флаконов или к пробкам. Открыть флаконы и положить пробки перевернутыми на сухую поверхность. В каждый флакон с калибровочной пробой и контрольной сывороткой внести по 0,5мл дистиллированной воды и закрыть пробки. Выдержать флаконы в течение 10минут при комнатной температуре (+18...25°С). Затем, аккуратно наклоняя и вращая флаконы, перемешать их содержимое до полного растворения, избегая пенообразования. В течение следующих 10минут выдержать флаконы при комнатной температуре, периодически перемешивая.

Жидкие калибровочные пробы и контрольная сыворотка готовы к использованию.

7.2. Стрипы. Перед вскрытием пакет необходимо выдержать при комнатной температуре в течение 30минут. Открыть пакет и переставить на свободную рамку необходимое количество стрипов. Оставшиеся стрипы хранить в пакете с герметично закрытым замком при температуре +2...8°С в течение всего срока годности.

7.3. Промывочныйбуфер. Необходимое количество БуфераР развести дистиллированной водой в 10раз. Например:

5мл БуфераР + 45мл дистиллированной воды.

Тщательно перемешать, избегая пенообразования. Хранить закрытым при комнатной температуре не более 5суток. Оставшийся неиспользованным БуферР хранить закрытым при температуре +2...8°С в течение всего срока годности.

7.4. Конъюгат анти-ЛГ-пероксидаза готов к использованию.

7.5. Раствор ТМБ готов к использованию.
7.6. Стоп-реагент готов к использованию.


8. ПРОВЕДЕНИЕ АНАЛИЗА

8.1. Все реагенты перед проведением анализа должны быть тщательно перемешаны и доведены до комнатной температуры. На последней странице приведена схема проведения анализа.

8.2. Составить протокол маркировки лунок. Лунки промаркировать следующим образом:
А1, А2 — №1 для измерения величины оптической плотности раствора ТМБ;
В1, В2 — № 2 для калибровочной пробы № 1;
С1, С2 — № 3 для калибровочной пробы № 2;
D1, D2 — № 4 для калибровочной пробы № 3;
Е1, Е2 — № 5 для калибровочной пробы № 4;
F1, F2 — № 6 для калибровочной пробы № 5;
G1, G2 — № 7 для калибровочной пробы № 6;
H1, H2 — № 8 для контрольной сыворотки.

8.3. Во все лунки, кроме А1 и А2, внести по 100мкл раствора конъюгата анти-ЛГ-пероксидаза.

8.4. Внести в соответствующие лунки по 20 мкл калибровочных проб и контрольной сыворотки, в оставшиеся лунки по 20мкл исследуемой сыворотки крови в дубликатах.

8.5. Инкубировать стрипы при встряхивании в течение 1часа в термостатируемом шейкере при температуре +37°С со скоростью 500–800об/мин.

8.6. По окончании инкубации удалить содержимое лунок декантированием и промыть лунки пять раз. При каждой промывке во все лунки добавить по 300 мкл промывочного буфера, приготовленного по п. 7.3, встряхнуть рамку на шейкере в течение 5–10сек. с последующим декантированием. После последнего декантирования тщательно удалить остатки жидкости из лунок постукиванием рамки со стрипами в перевернутом положении по фильтровальной бумаге.

8.7. Немедленно внести во все лунки по 100мкл раствора тетраметилбензидина. Инкубировать стрипы в темноте при комнатной температуре (+18…25°С) в течение 15–30минут в зависимости от степени развития окраски.

8.8. Добавить во все лунки с той же скоростью и в той же последовательности, как и раствор тетраметилбензидина, по 100мкл стоп-реагента для остановки ферментной реакции, встряхивать на шейкере в течение 1–2 мин.

8.9. Измерить на фотометре вертикального сканирования оптическую плотность раствора в лунках при длине волны 450 нм.

Если программа фотометра позволяет вычитать величину оптической плотности в лунках А1 и А2 из значений оптических плотностей всех остальных лунок, то для дальнейших расчетов необходимо использовать величину В— среднее значение оптической плотности в лунках, содержащих калибровочные или исследуемые пробы. В линейных координатах построить для калибровочных проб график зависимости В (ед.опт.плотн.) от концентрации ЛГ в калибровочных пробах (мМЕ/мл).

Если программа фотометра не позволяет вычитать величину оптической плотности лунок А1 и А2, то необходимо пользоваться формулой В–BТ, где ВТ— среднее значение оптической плотности лунок А1 и А2. Определить содержание ЛГ в пробах по калибровочному графику.
8.10. Если по техническим причинам невозможно измерить оптическую плотность в лунках планшета непосредственно после выполнения п. 8.8, то следует иметь в виду, что окраска в лунках планшета стабильна в течение 20минут при температуре +2...8°С.


9. УСЛОВИЯ ХРАНЕНИЯ И ЭКСПЛУАТАЦИИ НАБОРА
9.1. Набор «ГонадотропинИФА-ЛГ» должен храниться в упаковке предприятия-изготовителя при температуре +2... 8°С в течение всего срока годности. Допускается хранение набора при температуре до +25°С не более 5суток.
Срок годности набора — 12 месяцев.

В случае дробного использования компоненты набора необходимо хранить следующим образом:

· стрипы хранить в герметично закрытом пакете с замком при температуре +2...8°С в течение всего срока годности;

· восстановленные (растворенные) из лиофилизованных препаратов калибровочные пробы и контрольную сыворотку хранить при температуре +2...8°С не более 1месяца;

· жидкие, готовые к использованию, калибровочные пробы и контрольную сыворотку после вскрытия флаконов хранить не более 1 месяца при температуре +2...8°С;

· конъюгат анти-ЛГ-пероксидаза и раствор ТМБ после вскрытия флаконов хранить не более 1месяца при температуре +2...8°С;

· промывочный буфер, подготовленный к использованию, хранить закрытым не более 5суток при комнатной температуре (+18...25°С);

· БуферР и стоп-реагент после вскрытия флаконов хранить в течение всего срока годности при температуре +2...8°С.

9.2. Для проведения анализа не следует использовать плазму крови, гемолизированную, мутную сыворотку крови, а также сыворотку, содержащую азид натрия.

9.3. При вскрытии и растворении лиофилизованных компонентов необходимо следить, чтобы на крышке и стенках флаконов не оставалось сухого вещества.

9.4. При использовании набора для проведения нескольких независимых серий анализов необходимо иметь в виду, что для каждого независимого эксперимента необходимо построение нового калибровочного графика, кроме этого рекомендуется определение концентрации ЛГ в контрольной сыворотке.

9.5. Запрещается использовать стоп-реагенты из наборов реагентов других фирм-производителей.

9.6. Для получения надежных результатов необходимо строгое соблюдение инструкции.

По вопросам качества набора «ГонадотропинИФА-ЛГ» обращаться по адресу: 189650, г. Санкт-Петербург, п. Песочный, ул. Ленинградская, д. 70/4, тел/факс: (812) 596-67-80, или в ИГКЛС НЦ ЭГКЛС МЗ РФ по адресу: 117246, Москва, Научный проезд, д. 14А, тел. (095) 120-60-95.